紫一葡萄籽 ￥148

葡萄籽中的提取物，很多具有活性。其中原花青素的比较好的。原花青素属生物黄酮类,可从许多植物中提取得到,如海岸松、葡萄、银杏、山楂、可可、苹果等,具有显著的抗突变、降血压、抗菌、抗病毒、抗心血管损伤、抗癌等活性,有维生素P之称。自发现原花青素以来,国外对其药理活性进行了许多体内、体外和离体细胞实验研究,但国内这方面的研究起步较晚,只有零星报道。本研究采用生物化学发光法和分光光度法,测定了葡萄籽原花青素提取物(grapeprocyanidinsextract,GPE)清除活性氧、活性氮、抗脂质过氧化及对DNA氧化损伤的保护功效,为开发相关保健品和药用品提供自由基生物学方面的新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂　黄嘌呤、邻菲罗林、鲁米诺系Sigma产品。迭氮钠为国产化学纯。DNA系上海牛奶公司综合厂产品。酵母干粉、调理酵母多糖、黄嘌呤氧化酶系本实验室自制。邻苯三酚、过氧化氢、抗坏血酸、硫酸铜、硫酸亚铁、三氯乙酸、硫代巴比妥酸等均系国产分析纯。
1.1.2　仪器　SHG-1型生物化学发光测量仪(上海检测技术研究所上立仪器厂产品)。751-GW型分光光度计(上海分析仪器厂产品)。宝生牌臭氧多功能消毒机(凯鑫轻工有限公司产品)。

1.2 GPE的提取

根据文献报道方法进行。新鲜巨峰葡萄(产自上海嘉定区马陆乡)籽洗净,于烘箱内40℃恒温干燥。取纯葡萄籽100g粉碎,用300ml50%丙酮浸泡24小时,离心取上清液,重复三次。合并上清液后抽滤,滤液用石油醚萃取,收集下层褐色液体,重复萃取三次。下层褐色液体于60℃旋转蒸发,所得浓缩液再用乙酸乙脂与水的混合液(体积比为2∶3)进行新一轮萃取,重复萃取三次。收集水相物质冷冻干燥得GPE粉末,高效液相层析检测其原花青素成分含量达80%以上。

2.2 对•OH的清除作用

GPE能有效清除•OH,且量效关系显著,IC50约为90μg/ml。

2 结　果

2.1 对O•2的清除作用

检测O•2、•OH、H2O2和全血吞噬细胞呼吸爆发产生的多种活性氧的化学发光按文献进行。检测ONOO-(过氧亚硝基阴离子)的化学发光按照文献报道的方法进行。检测Fe2+诱发脂蛋白多不饱和脂肪酸过氧化的比色法按文献报道方法进行。检测DNA损伤的化学发光按文献进行。

2.3 对H2O2的清除作用

GPE能有效抑制H2O2-鲁米诺-OH-体系的化学发光,剂量依赖效应明显,IC50约为0.5μg/ml。GPE能明显抑制由黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系产生的O•2所引起的化学发光,量效关系明显。其半抑制浓度(IC50)约为0.2μg/ml。

2.4 对ONOO-的清除作用

2.5 抗脂质过氧化作用

O3和NaN3反应产生的ONOO-可氧化鲁米诺并使之受激发光。抗氧化剂清除ONOO-即可抑制该体系发光。GPE能有效清除ONOO-,清除率随浓度增大而增大,IC50约为130μg/ml。

2.6 对全血嗜中性白细胞吞噬发光的影响

全血嗜中性白细胞吞噬调理酵母多糖时,出现“呼吸爆发”,产生O•2、•OH、H2O2和1O2等活性氧,活性氧使鲁米诺受激发光。清除活性氧即可降低该体系发光强度。GPE能显著抑制全血嗜中性白细胞吞噬发光,量效关系显著,IC50约为10μg/ml。

2.7 对•OH引起的DNA损伤的保护作用

3 讨论

CuSO4-Phen-Vit.C-H2O2-DNA化学发光体系的发光曲线会出现前后两个峰,前峰代表Phen本身氧化发光,后峰代表体系中产生的•OH攻击DNA,形成DNA损伤产物而发光。加入保护剂可使后峰峰值下降,有些保护剂还可使后峰峰位随浓度的增大而后移。GPE对•OH引起的DNA损伤保护作用。本实验前峰不明显,在对照组(0μg/ml)及低浓度(1025μg/ml)曲线上不能见到,只有当后峰(在对照组位于6s处)峰位后移以后,才在3s处显现;后峰则十分显著,且其峰值随药物浓度的增大而迅速下降,峰位随药物浓度的增大而迅速后移,在25μg/ml时峰值即被抑制了约70%,峰位也已被后移至42s处(后移了约36s)。

细胞的正常代谢活动也会产生包括活性氮在内的各种活性氧,但正常情况下机体各种抗氧化酶或抗氧化剂能维持活性氧代谢的平衡。一旦这种平衡打破,造成体内活性氧积聚,即可引起机体病变。人类的多种疾病,括肿瘤、心脑血管病、糖尿病、老年痴呆症等,以及衰老都与活性氧有关。本研究结果显示GPE能显著抑制全血嗜中性白细胞吞噬发光,表明GPE能有效清除多种活性氧,是一种有效的活性氧清除剂。值得提及的是O•2和•OH这两种活性氧,前者是各种活性氧的源头,后者是氧化活性最强的活性氧。本研究显示GPE能有效清除这两种活性氧,即既能堵住活性氧产生的源头O•2,又能清除氧化作用最强的•OH,揭示了GPE的高效抗氧化机制。近年来的研究表明,活性氮如NO、ONOO-等对机体造成的损伤,主要是由ONOO-所引起,所以清除ONOO-对于保护机体免受氧化损伤十分重要。本实验结果显示GPE清除ONOO-的IC50为130μg/ml,是一种有效的ONOO-清除剂。我们的实验还显示GPE对H2O2的清除能力尤其卓越,IC50仅为0.5μg/ml。脂质过氧化产物寿命较长,具疏水性,易于透过细胞膜系统结合于DNA,生成脂质。

本研究揭示,GPE是一种良好的抗氧化剂及DNA保护剂,这为GPE药用及保健品的研发提供了自由基生物学的理论依据。

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